空间转录组学为生物学家提供了他们数十年来一直渴望的能力：观察一片组织切片，并以全基因组精度查看每个位置哪些基因被激活。这项技术从发育生物学到癌症研究的众多领域都具有变革意义，揭示了细胞如何组织成组织，肿瘤如何重塑其微环境，以及器官如何在发育过程中形成。
但有一个问题。大多数空间转录组学平台并不捕获单细胞。它们捕获的是斑点，小的圆形或方形组织区域，每个区域包含一到十几个细胞。单个斑点处测量的RNA是位于该处的所有细胞类型的混合信号。例如，位于肿瘤和血管边界的斑点可能包含癌细胞、内皮细胞和免疫细胞的混合物。要理解其中的生物学意义，需要解开这种混合物，这一过程称为反卷积。
多年来，反卷积的标准方法在概念上很简单：引入一个单独的参考数据集（通常来自单细胞RNA测序），该数据集能显示每种细胞类型的转录特征。然后利用该参考来分解空间数据，为每个斑点分配每种细胞类型的比例。当拥有来自完全相同组织和条件的高质量配对参考时，这种方法效果很好。
但这是一个很大的”条件”。
参考难题
配对单细胞参考的生成成本高昂且耗时。它们需要将组织解离成单个细胞，这一过程会破坏空间背景，并可能引入偏差。许多重要的组织样本，临床活检、存档的FFPE标本、稀有的发育样本，根本无法与来自同一标本的新鲜单细胞数据集配对。
即使存在参考，也可能不是良好的匹配。单细胞和空间转录组学平台具有不同的捕获效率、基因检测率和偏差。来自不同捐赠者、疾病阶段或实验室的参考会引入难以与真实组织生物学区分的生物变异。标记基因列表是一种常见的变通方法，但它们较为粗糙，会遗漏微妙的细胞状态，并且在陌生组织中完全失效。
这造成了一个先有鸡还是先有蛋的问题。需要知道存在哪些细胞类型才能分析空间数据，但又需要空间数据才能理解存在哪些细胞类型。参考不是有益的补充，而成为了限制空间转录组学研究范围的先决条件。
RETROFIT：无需参考的反卷积
今天发表在《自然·通讯》上的一项新方法打破了这种依赖。该方法名为RETROFIT（空间转录组学中细胞类型混合物的免参考反卷积），是一种贝叶斯框架，直接根据测序测量结果本身工作，无需在反卷积阶段使用任何外部参考。
由宾夕法尼亚州立大学团队（Roopali Singh、Xi He、Xinyue Wang、Adam Keebum Park、Ross Cameron Hardison、Xiang Zhu和Qunhua Li）开发的RETROFIT将免参考性质视为核心设计约束，而非需要绕过的限制。
核心见解是数学性的。空间转录组学数据集中的每个斑点都记录了一个基因表达值向量，同时在成百上千个斑点上测量数千个基因。如果有足够的斑点和足够的基因，数据本身的结构就包含分离细胞类型所需的信息。不同的细胞类型表达不同的基因组合，这些组合模式在原始数据矩阵中留下统计特征。挑战在于如何提取它们。
RETROFIT将其构建为贝叶斯非负矩阵分解问题。它将空间转录组学数据矩阵分解为两个较小的矩阵：一个捕获细胞类型特异性基因表达谱（每种细胞类型的特征），另一个捕获每个斑点处每种细胞类型的比例（每种细胞类型的位置）。贝叶斯方法为模型提供了一种处理不确定性的原则性方式，具有模糊混合的斑点会被标记出来，而非过度自信地分配，非负约束确保解在生物学上是可解释的：没有负的表达值或负的比例。
该方法使用结构化随机变分推理算法，能够高效扩展到典型空间转录组学数据集的规模，这些数据集可能包含数千个基因和数万个斑点。
至关重要的是，RETROFIT的架构将反卷积步骤与细胞类型标记步骤分开。该方法首先仅从空间数据中学习潜在的细胞类型成分。只有在识别出这些成分之后，它才会选择性地使用外部信息（单细胞参考或标记基因列表）来为其发现的成分分配生物学名称（例如”CD4+ T细胞”、”肝细胞”）。这种两阶段设计意味着核心分解永远不会受到参考偏差的污染。参考在使用时只是一个标签，而非拐杖。
性能表现
宾夕法尼亚州立大学团队对RETROFIT与免参考和基于参考的替代方法进行了广泛测试。在已知真实细胞类型组成的人造模拟中，RETROFIT优于现有的免参考方法。更重要的是，即使基于参考的方法获得完美匹配的参考，RETROFIT也达到或超过了它们的性能。
最后这一结果令人震惊。它表明基于参考的反卷积尽管广受欢迎，可能正在引入误差而非消除误差，来自平台效应、细胞类型覆盖不完全或生物学状态不匹配的误差。RETROFIT通过立足于正在分析的数据来避免所有这些问题。
在不完美的参考（基于参考的方法最难以应对的现实情况）下，优势变得更加明显。当团队引入不匹配的参考（模拟使用来自不同捐赠者的公共参考代替配对参考的常见场景）时，基于参考的性能大幅下降。RETROFIT的性能则保持不变。
无需图谱即可观察精细结构
最具说服力的演示可能来自Visium HD数据。10x Genomics发布的Visium HD代表着空间转录组学分辨率的一次飞跃，将标准的55微米斑点替换为接近单细胞尺度的连续2微米特征。但即使在更高分辨率下，单个像素仍然可能包含细胞类型的混合物，Visium HD更精细的结构引入了新的数据稀疏性挑战，考验着反卷积方法的极限。
RETROFIT在Visium HD数据上表现出色，无需单细胞参考或标记基因即可恢复精细的空间模式。该方法识别出空间上连贯的细胞类型域，特定细胞类型占主导的区域，与已知的组织解剖结构相匹配，所有结果完全源自空间表达数据的结构。
这对于越来越多采用高分辨率空间平台的研究人员来说尤其有价值。无需匹配的scRNA-seq参考即可分析Visium HD数据的能力消除了一个主要入门障碍，并加速了从组织切片到生物学洞见的转化。
广泛适用性
RETROFIT不限于任何单一平台。该团队在多种空间转录组学技术上展示了其有效性，包括Slide-seq（使用条形码微珠）和10x Visium平台。该方法能够处理不同斑点大小、不同捕获效率以及不同平台特有的各种基因检测率，无需重新调整参数。
该方法现已作为名为”retrofit”的Bioconductor R软件包提供，包含模拟和真实数据的完整文档和教程。这使得在Bioconductor生态系统中工作的广大计算生物学家社区可以访问使用。
新的前进道路
RETROFIT的发表并不会使基于参考的反卷积过时。当存在高质量、配对的单细胞参考时，基于参考的方法仍然是强大的工具。但RETROFIT改变了默认假设。研究人员不再需要问”我是否有足够好的参考来分析我的空间数据？”，而是可以问”我的空间数据本身揭示了什么？”并在之后添加参考进行生物学解释。
这一转变恰逢其时。空间转录组学正在迅速扩展，进入临床实验室、发育生物学，以及植物生物学和微生物学等配对单细胞参考稀少或根本不存在的领域。一种跨平台和分辨率工作的免参考方法使空间转录组学成为一种更民主的技术，任何拥有组织切片和测序仪的实验室都可以使用。
对于日益壮大的绘制基因表达空间组织的科学家群体，RETROFIT提供了一种简单而强大的能力：无需事先知道在寻找什么，就能看到存在什么。
Reference: Singh, R., He, X., Wang, X., Park, A. K., Hardison, R. C., Zhu, X., & Li, Q. RETROFIT: Reference-free deconvolution of cell-type mixtures in spatial transcriptomics. Nature Communications (2026). DOI: 10.1038/s41467-026-74928-7
婷 翻译