多年来，无细胞系统一直是合成生物学中强大但有限的工具。它使研究人员能够在活细胞之外进行转录和翻译，非常适合基因电路的原型设计、困难蛋白质的生产以及生物传感器的构建。但一直存在一个权衡：这些系统的信使RNA（mRNA）产量通常太低，无法进行全基因组转录组分析。
来自INRAE和巴黎-萨克雷大学的一个团队现在突破了这一障碍。利用贝叶斯优化搜索160万种可能的缓冲液组成组合空间，他们在标准的大肠杆菌（E. coli）无细胞系统中将mRNA产量提高了20倍，足以首次进行完整的转录组测序，并揭示基因调控的渐进层次。这项研究于6月27日发表在《Nature Communications》上。
教老系统新技能
起点是由T7 RNA聚合酶驱动的大肠杆菌BL21(DE3)裂解液系统，这是无细胞合成生物学中使用最广泛的平台之一。由Micalis研究所的Matthieu Jules和Olivier Borkowski领导的团队需要克服一个根本问题：标准缓冲液配方是在几十年前为蛋白质生产优化的，而不是为mRNA产量。
他们确定了八种缓冲液成分，包括镁、钾、氨基酸、NTP和PEG-8000，并将每种成分在六个浓度水平上进行变化。完整的组合空间包含1,679,616种可能的组成。即使通过暴力测试其中一小部分也是不可行的。
因此，团队转向了主动学习。贝叶斯优化算法从拉丁超立方抽样选择的100种组成开始，通过仅测试实验室中的653种组成，探索了160万种可能性的空间。经过十个主动学习周期，它确定了一种配方，使mRNA产量相对于参考缓冲液提高了20倍。
“主动学习将我们引导到了一个通过试错极不可能找到的组成空间区域，”作者指出。关键的调整是：更高的镁和NTP浓度，更低的钾、氨基酸和PEG-8000。
从优化到转录组
20倍的产量提升使无细胞系统此前无法实现的事情成为可能：全基因组直接RNA测序。团队转向了噬菌体T7，这是一种基因组紧凑、特征明确的病毒，并使用Oxford Nanopore的MinION平台在三个生物复杂性递增的系统上进行了直接RNA测序。
第一个系统仅使用纯化的T7 RNA聚合酶、DNA模板和核苷酸，这是最简配置。它捕捉了启动子强度层次：哪些T7启动子在其天然基因组背景下是强的或弱的。但由于不存在RNA降解机制，覆盖度严重偏向于转录本的5’端。
第二个系统使用了优化后的无细胞提取物，包含全部大肠杆菌蛋白质。这恢复了RNase III活性，在T7转录本中观察到mRNA成熟位点，并在整个转录本中产生了均匀的覆盖度，这是真正的稳态快照。它提供了体内表达水平的准确估计。
第三个系统是完全的细胞环境，即正在经历T7感染的大肠杆菌。这增加了一层无细胞裂解液中不存在的调控：由膜相关RNase E引起的3’端偏倚覆盖度。
比较揭示了作者所称的”渐进调控层次”：启动子强度、mRNA降解、通过RNase III的mRNA成熟以及通过RNase E的3’端特异性降解。每个系统增加了一层或多层，创造了生物复杂性的梯度，使团队能够单独剖析每个过程。
更广泛的意义
这项研究表明，长期以来被认为不适用于转录组学的无细胞系统现在可以分析整个细菌转录组。”无细胞转录组学可以探索不可培养细菌的转录景观，”研究人员指出，这些生物仅仅因为它们的RNA在实验室条件下无法获取而仍然缺乏特征描述。
主动学习流程本身可以推广到缓冲液优化之外。任何多参数生物优化问题，包括培养基配方、蛋白质纯化条件、代谢工程，都可以受益于相同的方法，即探索组合空间的0.04%以找到接近最优的条件。
局限性仍然存在。该研究仅在使用T7 RNA聚合酶的大肠杆菌BL21(DE3)裂解液中进行。优化后的缓冲液尚未针对内源性大肠杆菌RNA聚合酶或其他生物进行验证。无细胞系统捕获转录和降解，但不捕获由膜相关RNase E介导的3’端特异性降解，后者在裂解液制备过程中丢失。此外，该论文作为尚未经过编辑完善的预发表版本发布。
尽管如此，这项工作标志着无细胞生物学的转折点。通过将转录组学纳入无细胞系统的能力范围，它为研究不可培养生物中的基因调控、在RNA水平上原型设计合成电路以及加速合成生物学中的设计-构建-测试循环打开了大门。
该论文”Active-learning-guided optimization of cell-free systems for genome-wide transcriptomic profiling reveals progressive layers of regulation”发表在《Nature Communications》上（DOI: 10.1038/s41467-026-74559-y），作者为Lea Wagner、An Hoang、Olivier Rue以及INRAE、巴黎-萨克雷大学和AgroParisTech的同事们。
婷 翻译