将基因插入人类细胞的标准方法需要在精确位置切断DNA双螺旋的两条链。细胞感知到灾难，急忙进行修复，如果正确的供体模板在附近，它有时会利用该模板修补断裂，从而整合新的遗传物质。这种在Cas9诱导的双链断裂后进行同源定向修复的方法，十年来一直是基因敲入的支柱。但它也受到其所依赖的生物学的根本性制约。
双链断裂就是问题所在。细胞有多种方式修复DNA两条链的干净切断，而研究人员想要的那种——同源定向修复（HDR）——是细胞最不喜欢的选项。细胞会选择非同源末端连接（NHEJ），这是一种更快、容易出错的途径，它把断裂的末端缝合在一起，但经常引入小的插入或缺失（即indel）。即使HDR成功，也经历了NHEJ的细胞中存在indel会使编辑后的群体变得复杂。在整体生物体尺度上，未被检测到的易位——断裂的染色体与错误伙伴融合的大规模重排——仍然是一个持续令人担忧的问题。
由清华大学王海峰领导的一个团队在《自然》杂志上发表了一种根本不同的策略。称为CRISPR千碱基级切口酶靶向（KNIT）编辑，该方法根本不破坏基因组。它只制造切口，仅切割DNA双螺旋的一条链，并使用分子招募系统将供体DNA直接递送到切口位点。这种区别不是渐进的。通过避免双链断裂，KNIT完全绕过了NHEJ，几乎消除了所有indel，最大限度地减少了易位，同时仍然达到与常规方法媲美或更高的敲入效率。
KNIT的工作原理
该系统依赖于两个分子组件。第一个是Cas9切口酶，是标准CRISPR酶的一个变体，其中单个氨基酸变化（D10A）使其两个核酸酶结构域之一失活。切口酶仅切割与其引导RNA互补的那条链，产生单链断裂（即切口），而不是双链断裂。第二个组件是一种融合蛋白：切口酶与单体链霉亲和素（mSA）连接，后者是一种经过修饰的细菌蛋白，能以极高亲和力结合生物素。
携带待插入基因、两侧带有与靶位点匹配的同源臂的双链DNA片段（供体DNA）经过生物素化学修饰。当切口酶-mSA融合蛋白在靶位点切割时，链霉亲和素结构域立即捕获生物素化的供体分子并将其固定在原位。细胞的内源修复机制在单链切口（而不是完全断裂）上运作，然后使用束缚的供体作为模板，在切口上合成新的DNA。结果是在从未切断基因组两条链的情况下精确整合供体序列。
这种设计解决了先前基于切口酶的方法所受的限制。单一切口本身难以刺激HDR，因为细胞对切口的处理方式与断裂不同。促进HDR的修复机制主要由双链断裂激活。通过将供体直接招募到切口位点，KNIT人工地将模板浓缩在可以使用的地方，补偿了较弱的修复信号。
跨细胞类型和插入尺寸的性能
作者在多种人类细胞系中测试了KNIT，包括HEK293T（胚胎肾）、K562（慢性粒细胞白血病）、Jurkat（T细胞白血病），以及最重要的是，从健康供体分离的人类原代T细胞。在这些细胞类型中，根据基因座和供体设计的不同，敲入效率达到高达89%。
该系统处理的插入大小从0.7千碱基到超过10千碱基，涵盖了大多数治疗性转基因所需的范围，包括带有调控元件的全长编码序列。多个基因组位点以相似的成功率被靶向，表明该系统对局部染色质环境不太敏感。
安全性是最显著的进步。在标准CRISPR敲入实验中，靶位点的indel率通常在10%到50%或更高，反映了NHEJ和HDR修复途径之间的竞争。使用KNIT，indel降至1%以下。因为没有双链断裂，NHEJ没有东西可修复。对编辑后细胞的高通量测序显示脱靶编辑极少，易位检测显示与传统的Cas9方法相比显著减少。
重复编辑而不积累损伤
KNIT低indel率的一个实际结果是细胞可以被多次编辑。在给定基因座的传统Cas9编辑会产生正确编辑的细胞、含有indel的细胞和未编辑细胞的混合物。第二轮编辑无法区分正确编辑的细胞和未编辑的细胞，但它会在两个群体中产生新的indel，逐渐降低细胞池的质量。KNIT以其低于1%的indel率，允许连续轮次的编辑而不积累垃圾突变。作者通过在同一基因座成功进行两轮KNIT编辑并观察到indel没有显著增加来证明这一点。
该系统还支持在多个位点同时编辑，这是设计复杂细胞疗法日益重要的能力。在同一细胞中靶向两个或三个位点的多重敲入，产生了对治疗应用仍然有用的效率，并且靶向位点之间的易位率极低。
KNIT Editor 2：单次转染，更高效率
最初的KNIT系统需要将切口酶-mSA融合蛋白和生物素化的供体DNA都递送到细胞中。作者开发了一个增强版本KNIT Editor 2（KE2），将组件整合到单个优化载体中，消除了单独的供体转染，并改善了切口酶和供体模板之间的化学计量比。KE2在多种细胞类型中显示出敲入效率的进一步提高，同时保持了相同的低indel率。
在突变细胞中恢复IL2RG
为了测试治疗实用性，团队将KNIT应用于携带IL2RG基因病理性突变的细胞。IL2RG功能丧失突变导致X连锁重症联合免疫缺陷病（SCID-X1），患者缺乏功能性T细胞和自然杀伤细胞。KNIT将功能性IL2RG拷贝插入天然基因座或AAVS1安全港基因座。在两种情况下，编辑后的细胞都恢复了正常的IL2RG表达，证明了在不带来双链断裂风险的情况下纠正了疾病相关的基因缺陷。
无需病毒载体或双链断裂构建CAR-T细胞
最直接可转化的应用可能在细胞治疗工程中。嵌合抗原受体（CAR）T细胞——将患者的T细胞重新编程以识别和杀死癌细胞——代表了最成功的细胞治疗类别之一。当前制造依赖病毒载体（慢病毒或逆转录病毒）递送CAR转基因，这增加了成本、监管复杂性以及虽小但非零的插入突变风险。非病毒工程方法也存在，但大多数依赖于Cas9诱导的双链断裂，这触发了同样的NHEJ问题。
KNIT仅使用电穿孔质粒组件就能生产功能性CAR-T细胞，无需病毒载体和双链断裂。由此产生的CAR-T细胞在临床相关水平表达CAR，并在体外对靶癌细胞表现出强大的细胞毒性活性。在白血病小鼠异种移植模型中，KNIT工程化的CAR-T细胞与常规工程细胞一样有效地控制肿瘤生长，且没有indel负担。
更大的图景
KNIT并非近期在无双链断裂大片段DNA插入方面的唯一进展。基于先导编辑、桥RNA重组酶和四重pegRNA方法的系统都已展示了减少附带损伤的可编程敲入。KNIT的与众不同在于其简单性：单个切口酶融合蛋白、一个生物素化供体，以及临床细胞制造中已使用的标准电穿孔条件。
该领域正在趋同于一个几年前可能被认为是激进的原则：将DNA插入人类基因组的最安全方式是首先不破坏它。KNIT提供了一个实用的实现，其效率表明临床转化值得探索。对于离体细胞工程——细胞从患者体内取出、编辑后再送回——通往临床试验的路径相当清晰。第一批KNIT工程化CAR-T细胞可能在未来几年内进入人体试验，如果实验室观察到的安全性谱在患者身上得到验证，这种方法可能会改变细胞治疗的制造方式。
婷 翻译
参考文献
Wang, H. et al. (2026). CRISPR kilobase-scale nickase-targeting (KNIT) editing for large DNA insertion without double-strand breaks. Nature. DOI: 待确认