合成生物学中的重大挑战之一是构建自然界不存在的酶，并让它们在活细胞中工作。人工酶通过将合成催化辅因子嵌入蛋白质支架中构建，已在试管中发展多年。但活细胞拥挤、化学环境复杂的细胞质一直是一个难以逾越的障碍。扩散受限，活性副产物大量存在，条件远非体外反应中精心控制的缓冲液可比。
由江南大学和厦门大学的研究人员领导的团队现已突破了这一障碍。在7月2日发表在《自然·通讯》上的一项研究中，他们报告了首个在活细胞内直接组装人工酶的有效策略，这些酶以优异的立体化学控制催化不对称碳-碳键形成反应。
“复杂的细胞环境对人工酶设计提出了诸多挑战，”江南大学生命科学与健康工程学院的通讯作者周志说。”我们的方法模仿了天然酶的成熟方式：细胞表达一个蛋白质支架，然后我们将其与能够自行锚定的合成辅因子一起孵育。”
工作原理
该策略简约而优雅。研究人员改造了细菌细胞，使其表达含有策略性放置的半胱氨酸氨基酸的靶蛋白。然后他们向细胞培养物中添加了合成催化辅因子，这是一种旨在执行特定化学转化的小分子。辅因子扩散穿过细胞膜，与半胱氨酸残基形成位点特异性二硫键，将辅因子锁定在蛋白质支架中。
结果是在细胞质内完全组装了一个功能性人工酶，执行不对称曼尼希反应，这是有机化学中一种基础性的碳-碳键形成转化，用于构建具有确定三维结构的复杂分子。
该反应实现了优异的对映选择性，意味着该酶持续产生一种镜像产物而非另一种。对于药物化学而言，分子的两种镜像形式可能具有完全不同的生物效应，对映选择性就是药物与毒物之间的区别。
晶体学分析和计算研究（包括密度泛函理论和量子力学/分子力学模拟）揭示了立体选择性的结构基础。蛋白质支架将辅因子定位在精确的方向上，创造了有利于一种反应路径而非其镜像替代路径的手性环境。
通用化平台
该研究的关键主张是该方法具有通用性。由于辅因子通过简单的二硫键（一种被充分理解且广泛使用的生化连接方式）锚定，相同的策略可以应用于不同的蛋白质支架和不同的合成辅因子。研究人员用特定的曼尼希反应催化剂测试了他们的系统，但其基本原理，表达支架、添加辅因子、让其自组装，是模块化的。
“该方法不需要任何特殊试剂或基因工程，只需在支架的正确位置放置一个半胱氨酸即可，”厦门大学的通讯作者王斌举说。”这意味着只需更换辅因子或蛋白质，就可以适应许多不同的反应。”
这种模块化为在细胞内构建人工酶库打开了大门，每种酶催化不同的反应，无需纯化、重构或递送预组装的酶复合物。对于代谢工程和生物合成等需要在单个细胞内顺序完成多个酶步骤的应用而言，按需安装人工酶的能力是一项重大进展。
不对称曼尼希反应为何重要
曼尼希反应是有机化学中最重要的碳-碳键形成反应之一。它产生β-氨基羰基化合物，这些化合物是大量天然产物和药物的构建模块。不对称版本（仅产生一种对映体）尤其有价值，因为生物系统通过三维形状识别分子。
一种能在活细胞内以天然酶的立体化学精度执行此反应的人工酶，为直接在生物合成途径中生产手性中间体提供了工具。与其在化工厂合成手性分子然后喂给工程微生物，微生物可以自己生产手性中心。
局限性与后续步骤
当前系统存在局限性。锚定辅因子的二硫键在细胞质中易被还原，这可能会限制酶的寿命并需要持续补充辅因子。反应范围虽有前景，但仅在特定底物类别上得到证实。研究人员指出，将该方法扩展到其他反应类型（氧化、还原、环化）将需要具有不同催化特性的辅因子。
不过，人工酶可以在细胞内组装这一演示代表了细胞内生物催化领域的阶跃性变化。它将该领域从”我们能构建人工酶吗？”推进到”我们能在哪里部署它？”。
来源： Zhu Z， Hu Q， Wu Y， Wang B， Zhou Z. Intracellular assembly of artificial enzymes for cytoplasmic enantioselective Mannich reactions. Nature Communications (2026). DOI: 10.1038/s41467-026-75059-9
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