几十年来，这个问题看似简单却难以给出明确答案：细胞穿透肽（CPPs），能够将治疗载荷运入细胞的短氨基酸序列，究竟如何穿过质膜？
这个答案对于药物递送至关重要。CPP是将大型带电分子（蛋白质、核酸、纳米颗粒）导入病变细胞细胞质的最有前景的策略之一。但如果不了解其机制，更好的递送载体的理性设计就只能靠猜测。相互竞争的理论，内吞作用、倒置胶束形成、地毯式膜去稳定化，各有其支持者，也各有其缺陷。
现在，一个法国研究团队提供了似乎是决定性的答案。在发表于《美国国家科学院院刊》（PNAS）的一项研究中，Evgeniya Trofimenko与来自五个法国研究机构的同事表明，CPP和同源异型蛋白通过瞬时亚毫秒孔隙穿过细胞膜，并且他们拥有电生理记录来证明这一点。
终于有了直接证据
该团队对单个细胞使用了双膜片钳技术，本质上是将两个电极插入一个细胞，一个用于维持膜电压，另一个用于检测电流，同时在细胞外表面施加CPP。他们记录到的是短暂、单一的电流尖峰，每个尖峰对应一个单个的孔隙开放事件。
这些孔隙的形成和关闭速度比任何已知的内吞事件都快，时间尺度在数百微秒到几毫秒之间。关键是，相同的转位在11°C下也能观察到，而在这个温度下内吞作用被完全阻断。该过程是能量非依赖性的，完全排除了主动运输。
孔隙是瞬时的：它们打开，让肽通过，然后重新密封。细胞膜保持完整，该过程没有细胞毒性。
GAG依赖性和电压敏感性
该机制有两个关键依赖因素。
第一，细胞表面糖胺聚糖（GAGs），覆盖大多数细胞类型的长链带负电糖链，是必需的。肽必须与硫酸乙酰肝素样GAG结合才能启动孔隙形成。在基因上缺乏GAG的细胞（CHO-psgA-745）中，完全没有发生转位。这解决了该领域一个长期存在的难题：为什么CPP摄取在不同细胞类型之间差异巨大。答案就是GAG密度。
第二，膜电压强烈调节该过程。超极化，使细胞内部更负，以超线性方式将转位频率提高了10到100倍。去极化几乎没有效果。这种电压敏感性为靶向递送提供了一个潜在的控制手段：具有更负静息电位的细胞（如神经元）可能对CPP介导的货物递送具有更高的自然接受性。
统一的机制
该研究最引人注目的发现之一是，相同的瞬时孔隙机制适用于广泛的肽。团队测试了四种CPP，Tat（来自HIV）、多聚精氨酸R9、穿透素和R6W3，以及两种同源异型蛋白（Otx2和Engrailed-2）。所有都表现出相同的基本机制和相似的动力学。
这种统一性很重要。同源异型蛋白是天然存在的转录因子，可以在生物体细胞间移动，这一过程被称为”信使蛋白”信号传导，已在发育生物学和神经生物学中被观察到。新研究表明，这些蛋白质使用与合成CPP完全相同的GAG依赖性、电压敏感性孔隙机制，这开启了围绕自然生物过程设计人工递送载体的可能性。
对药物递送的意义
这些发现至少在四个方面改变了基于CPP的疗法的实际前景：
1. 理性设计：无需凭经验筛选数千种肽变体，现在可以设计递送载体来优化GAG结合亲和力和电压敏感性。
2. 内体逃逸问题解决：内吞依赖型递送的主要失败之一是被内化的货物被困在内体中并被降解。瞬时孔隙机制完全绕过了内体，货物直接进入细胞质。
3. 货物递送验证：团队证明，CPP偶联的毒性货物（促凋亡肽KRAKLAK）通过瞬时孔隙途径成功进入细胞并杀死细胞，证明该机制能够实现治疗相关的递送。
4. 中枢神经系统潜力：在急性脑切片的大脑皮层锥体细胞中观察到了相同的孔隙机制，表明基于同源异型蛋白的载体可被开发用于中枢神经系统药物递送，这是一个众所周知的困难治疗前沿。
有待探索的问题
该研究确凿地建立了所测试肽的机制，但仍有几个问题。孔隙在分子水平上究竟如何形成，发生了什么样的脂质重排？孔隙大小是否可以调节以容纳更大的货物，如抗体或基因编辑复合物？最关键的是，这种机制能否从培养细胞和脑切片转化为活体生物中的治疗用途？
这些问题的答案将决定瞬时孔隙机制能否成为新一代递送技术的基础。但机制本身已不再有疑问。
资金：法国国家研究署（ANR-17-CE11-0050-CROSS， ANR-20-CE44-0018-GLYCOTARGET）。
来源
Trofimenko， E.， Gervasi， N.， Perez， S.， Rodriguez， N.， Ravault， D.， Cribier， S.， Berry， H.， Venance， L.， and Sagan， S. “Transient pores account for cell-penetrating peptide and homeoprotein translocation.” Proceedings of the National Academy of Sciences 123(26)， e2602649123 (2026). DOI: 10.1073/pnas.2602649123
婷 翻译