構造生物学がタンパク質工学を導いてきた限り、その論理は極めてシンプルだった。すべての原子がどこにあるかを決定し、基質に接触する部分を特定し、機能を向上させるためにそれらの部分を再設計する。CRISPR酵素に誤ったDNA配列の編集を停止させたい場合、それらの配列に接触する残基を見つけて変異させる。モデルは静的である。前提は「見ることが工学である」ということだ。
7月22日にNatureに発表された研究は、今、その前提そのものに疑問を投げかけている。北京大学のHaowei Meng、Zhixin Lei、Yongchang Yan、Liren Wang、Sihan Zhang、Xichen Raoの共同第一著者、および華東师范大学のDali Liと北京大学のChengqi Yiの責任著者によって率いられたこの研究は、ContactSeekを紹介する。これは、CRISPR複合体が「どこにあるか」ではなく、その各部分が「どこにあり得るか」を問うAIフレームワークである。静的構造から確率的接触へのこの転換は、従来の工学が達成できなかった結果を生み出している。
ContactSeekが取り組む問題は、ゲノム編集において最も厄介な問題の一つである。塩基編集因子：二重らせんを切断せずに個々のDNA文字を書き換える分子ツール：は大きな治療的潜在性を持つ。しかし、それらは十分に精密ではない。オフターゲット編集：意図した標的に似ているが一致しない部位での意図しない変化：は、臨床使用への障壁となっている。指向性進化と合理的設計により、漸進的に優れた変異体が生産されてきたが、これらのアプローチは遅く、労働集約的であり、しばしばオンターゲット活性を特異性のために犠牲にする。
北京大学のチームは異なるアプローチを取った。まず工学を行い後でテストする代わりに、DeepMindのAlphaFold3（AF3）が、変異が行われる前に、塩基編集因子のどの部分がオフターゲット挙動の原因であるかを予測できるかどうかを問うた。答えは、彼らが何を測定するかに依存することが判明した。
AlphaFold3は、原子精度でタンパク質の三次元構造を予測することで最もよく知られており、その能力は創設者にノーベル賞をもたらした。しかし、Mengたちは、予測された構造自体よりも、モデルが副産物として生成する別のものの方が情報量が多いことに気づいた。それは接触確率：側鎖原子が核酸鎖の約5オングストローム以内にある可能性を捉える残基ごとの指標：である。解像された構造が残基の「位置」を教えるのに対し、接触確率はそれが「そこにある可能性」を教える：単一のスナップショットではなく、分子の親密さの確率的地図である。
この区別が決定的であることが証明された。チームがAlphaFold3の予測したCas9のオンターゲットDNA配列とオフターゲットDNA配列に結合した構造を比較したところ、構造的な差は有用であるには小さすぎた。原子位置の二乗平均平方根偏差：三次元構造を比較する標準的な指標：はほとんど検出されなかった。対照的に、接触確率は検出可能な形で変化した。差は微妙で：サブオングストローム規模：だが一貫しており、複数のガイドRNAにわたって実験的に測定されたオフターゲット編集と相関していた。
確率が位置よりも敏感であるという洞察がContactSeekのエンジンとなった。このフレームワークは4段階で機能する。第一に、チームはdIプロファイリングと呼ばれる方法を用いて、アデニン塩基編集因子（ABE）のゲノム全体のオフターゲット部位をマッピングする。これにより、編集因子がゲノム全体にわたって作用する場所が捕捉される。第二に、AlphaFold3がCas9、ガイドRNA、DNAの三元複合体をオンターゲットと各オフターゲット配列の両方について予測し、すべての残基の接触確率行列を抽出する。第三に、ContactSeekがデルタCPを計算する。これは各残基におけるオフターゲットとオンターゲットの接触確率の差であり、コンセンサス接触領域（CCR）：オンターゲット複合体とオフターゲット複合体の間で接触パターンが一貫して変化する隣接Cas9残基のクラスター：を特定する。第四に、これらのCCR内で、最も強い接触変化を持つ残基が特異性決定残基として指名され、変異の優先順位が付けられる。
結果は、わずかな改善に慣れた分野の基準から見ても印象的である。Cas9の単一変異K1020Dは、HEK4ガイドRNA部位でABE8eのオフターゲット編集を83％、ABEsite16で69％減少させ、オンターゲット活性を維持した。このCas9変異と、ContactSeekによって特定されたTadA8eデアミナーゼドメインの変異H29Dを組み合わせることで、チームがABE8e-DDと呼ぶ変異体が生成され、ABEsite16でのゲノム全体のオフターゲット編集が99.2％減少した。この単一の変異体は、ABE8e-V28C、V106W、N108Qを含む、以前の指向性進化キャンペーンで開発された複数の高忠実度ABE変異体を凌駕した。
このフレームワークのモジュール性は、おそらくその最も重要な特徴である。ContactSeekはCas9やアデニン塩基編集因子に特異的ではない。チームはこれを全く異なる編集因子：APOBEC3Aデアミナーゼを使用したLbCas12aベースのシトシン塩基編集因子（CBE）：に適用した。Cas12a変異R284Eは、RUNX1ガイドRNA部位でのゲノム全体のオフターゲット編集を72.4％減少させた。これにAPOBEC3A H29D変異を組み合わせることで、Cas12a（R284E）-A3A（H29D）が生成され、複数のガイドRNAにわたってオフターゲット編集の95.1％減少を達成した。同じフレームワーク、同じ論理、全く異なる編集因子。
ContactSeekのより広い意義は、単一の結果を超えて広がっている。従来の構造誘導工学は、高分子複合体を静的な集合体として扱う。構造が真理であり、工学的決定はそこから導かれる。ContactSeekは複合体を可能性のアンサンブルとして扱う。オフターゲットDNAには高い確率で接触するが、オンターゲットDNAには低い確率でしか接触しない残基は、二つの状態間の距離が従来の構造アライメントでは測定できないほど小さくても、特異性決定残基である。この方法は、静的構造では解像できないノイズから信号を抽出する。
この確率論的アプローチは、治療と危険の差がたった一つの塩基対の置き違えであるゲノム編集に自然な居場所を持つ。しかし、それはおそらくさらに広がる。同じ推論：接触確率分布が静的構造にはない情報を含んでいる：は、特異性が重要なあらゆる生体分子系に適用できる。抗体-抗原認識、酵素-基質選択性、タンパク質-タンパク質相互作用工学。正しい標的と誤った標的の差がタンパク質が「どこにあるか」ではなく「どこにあり得るか」に符号化されているあらゆるプロセスが、ContactSeekスタイルの分析の候補である。
今のところ、当面の影響は塩基編集にある。ABE8e-DD変異体は、その2つの変異とオフターゲット編集のほぼ完全な除去により、アデニン塩基編集因子の忠実度に新たな基準を設定した。Cas12a（R284E）-A3A（H29D）変異体は、シトシン塩基編集因子についても同様である。両方とも、指向性進化、ハイスループットスクリーニング、試行錯誤なしに特定された。ContactSeekがそれらを予測し、実験がその予測を確認した。
研究者たちは、ContactSeek v1.0.0をGitHubとZenodoで公開している。AlphaFold3の予測出力とシーケンシングデータもすべて含まれている。コードは、実験的にマッピングされたオフターゲット部位が与えられれば、任意のCasエフェクターと任意のデアミナーゼで実行できるように設計されている。もはや制限要因は工学的能力ではなく、モデルに供給されるオフターゲットデータの質である。
ContactSeekが最終的に示しているのは、構造の解像度は問いの解像度ではないということだ。原子レベルで正確な三次元モデルでも、あるDNA配列を別のDNA配列から区別する相互作用パターンを見逃す可能性がある。位置ではなく確率が、関連する指標であることが判明した。これは、構造生物学：その分野を変革したAIツールにまだ追いつきつつある：がしばらくの間吸収し続ける教訓である。
雅子 訳