Desde que la biología estructural ha guiado la ingeniería de proteínas, la lógica ha sido elegantemente simple: determinar dónde se encuentra cada átomo, identificar las partes que tocan el sustrato y rediseñar esas partes para mejorar la función. Si quieres que una enzima CRISPR deje de editar las secuencias de ADN incorrectas, encuentras los residuos que contactan esas secuencias y los mutas. El modelo es estático. La premisa es que ver es ingeniería.
Un estudio publicado el 22 de julio en Nature ahora desafía esa premisa desde sus fundamentos. El trabajo, liderado por los co-primeros autores Haowei Meng, Zhixin Lei, Yongchang Yan, Liren Wang, Sihan Zhang y Xichen Rao de la Universidad de Pekín, con los autores correspondientes Dali Li de la Universidad Normal de China Oriental y Chengqi Yi de la Universidad de Pekín, presenta ContactSeek, un marco de IA que no pregunta dónde está un complejo CRISPR, sino dónde podrían estar sus partes. Y ese cambio de la estructura estática al contacto probabilístico está produciendo resultados que la ingeniería convencional no ha igualado.
El problema que ContactSeek aborda es uno de los más difíciles en la edición genómica. Los editores de bases, herramientas moleculares que reescriben letras individuales de ADN sin cortar la doble hélice, tienen un enorme potencial terapéutico. Pero no son lo suficientemente precisos. La edición fuera del objetivo, cambios no intencionados en sitios que se parecen pero no coinciden con el objetivo deseado, sigue siendo una barrera para el uso clínico. La evolución dirigida y el diseño racional han producido variantes incrementalmente mejores, pero estos enfoques son lentos, requieren mucho trabajo y a menudo sacrifican la actividad en el objetivo por la especificidad.
El equipo de la Universidad de Pekín adoptó un enfoque diferente. En lugar de diseñar primero y probar después, preguntaron si AlphaFold3 (AF3) de DeepMind podría predecir, antes de que se realizara cualquier mutación, qué partes de un editor de bases eran responsables de su comportamiento fuera del objetivo. La respuesta resultó depender de lo que midieran.
AlphaFold3 es conocido principalmente por predecir estructuras tridimensionales de proteínas con precisión atómica, una capacidad que le valió a sus creadores un Premio Nobel. Pero Meng y sus colegas se dieron cuenta de que las estructuras predichas en sí mismas eran menos informativas que algo más que el modelo produce como subproducto: la probabilidad de contacto, una métrica por residuo que captura la probabilidad de que los átomos de la cadena lateral se encuentren dentro de aproximadamente 5 angstroms de una hebra de ácido nucleico. Mientras que una estructura resuelta te dice dónde está un residuo, la probabilidad de contacto te dice qué tan probable es que esté allí, un mapa probabilístico de intimidad molecular en lugar de una instantánea única.
Esta distinción resultó crítica. Cuando el equipo comparó las estructuras predichas por AlphaFold3 de Cas9 unida a secuencias de ADN dentro y fuera del objetivo, las diferencias estructurales eran demasiado pequeñas para ser útiles. La desviación cuadrática media de las posiciones atómicas, la métrica estándar para comparar estructuras tridimensionales, apenas se registró. La probabilidad de contacto, por el contrario, cambió de manera detectable. Las diferencias eran sutiles, de escala sub-angstrom, pero eran consistentes y se correlacionaban con la edición fuera del objetivo medida experimentalmente en múltiples ARN guía.
La idea de que la probabilidad es más sensible que la posición se convirtió en el motor de ContactSeek. El marco funciona en cuatro etapas. Primero, el equipo mapea los sitios fuera del objetivo en todo el genoma para los editores de bases de adenina (ABE) mediante un método llamado dI-profiling, que captura dónde actúa el editor en todo el genoma. Segundo, AlphaFold3 predice el complejo ternario de Cas9, ARN guía y ADN tanto para la secuencia dentro del objetivo como para cada secuencia fuera del objetivo, extrayendo matrices de probabilidad de contacto para cada residuo. Tercero, ContactSeek calcula delta-CP: la diferencia entre la probabilidad de contacto fuera y dentro del objetivo en cada residuo, identificando regiones de contacto consenso (CCR), grupos de residuos vecinos de Cas9 cuyos patrones de contacto cambian consistentemente entre los complejos dentro y fuera del objetivo. Cuarto, dentro de estos CCR, los residuos con los cambios de contacto más fuertes son nominados como residuos determinantes de la especificidad y se priorizan para la mutación.
Los resultados son sorprendentes para los estándares de un campo acostumbrado a ganancias marginales. Una sola mutación en Cas9, K1020D, redujo la edición fuera del objetivo de ABE8e en un 83 % en el sitio de ARN guía HEK4 y en un 69 % en ABEsite16, mientras preservaba la actividad dentro del objetivo. La combinación de esa mutación de Cas9 con una mutación identificada por ContactSeek en el dominio desaminasa TadA8e, H29D, produjo una variante que el equipo llama ABE8e-DD, que logró una reducción del 99,2 % en la edición fuera del objetivo en todo el genoma en ABEsite16. Esta única variante superó a múltiples variantes ABE de alta fidelidad desarrolladas mediante campañas de evolución dirigida anteriores, incluyendo ABE8e-V28C, V106W y N108Q.
La modularidad del marco es quizás su característica más importante. ContactSeek no es específico para Cas9 ni para los editores de bases de adenina. El equipo lo aplicó a un editor completamente diferente: los editores de bases de citosina basados en LbCas12a (CBE) que utilizan la desaminasa APOBEC3A. Una mutación de Cas12a, R284E, redujo la edición fuera del objetivo en todo el genoma en un 72,4 % en el sitio de ARN guía RUNX1. La combinación de esta con una mutación H29D de APOBEC3A produjo Cas12a(R284E)-A3A(H29D), que logró una reducción del 95,1 % en la edición fuera del objetivo en múltiples ARN guía. El mismo marco, la misma lógica, un editor completamente diferente.
La importancia más amplia de ContactSeek se extiende más allá de cualquier resultado único. La ingeniería tradicional guiada por la estructura trata los complejos macromoleculares como conjuntos estáticos: la estructura es la verdad fundamental y las decisiones de ingeniería se derivan de ella. ContactSeek trata el complejo como un conjunto de posibilidades. Un residuo que contacta ADN fuera del objetivo con alta probabilidad pero ADN dentro del objetivo con baja probabilidad es un residuo determinante de la especificidad, incluso si la distancia entre los dos estados es demasiado pequeña para medirla mediante alineamiento estructural convencional. El método extrae señal del ruido que las estructuras estáticas no pueden resolver.
Este enfoque probabilístico tiene un hogar natural en la edición genómica, donde la diferencia entre un tratamiento y un peligro puede ser un solo par de bases mal colocado. Pero probablemente se extiende más allá. El mismo razonamiento, que las distribuciones de probabilidad de contacto contienen información que las estructuras estáticas no contienen, podría aplicarse a cualquier sistema biomolecular donde la especificidad importe: reconocimiento anticuerpo-antígeno, selectividad enzima-sustrato, ingeniería de interacciones proteína-proteína. Cualquier proceso donde la diferencia entre objetivos correctos e incorrectos esté codificada no en dónde se encuentra una proteína sino en dónde podría encontrarse es candidato para un análisis al estilo ContactSeek.
Por ahora, el impacto inmediato está en la edición de bases. La variante ABE8e-DD, con sus dos mutaciones y la eliminación casi completa de la edición fuera del objetivo, establece un nuevo punto de referencia para la fidelidad de los editores de bases de adenina. La variante Cas12a(R284E)-A3A(H29D) hace lo mismo para los editores de bases de citosina. Ambas fueron identificadas sin evolución dirigida, sin cribado de alto rendimiento, sin prueba y error. ContactSeek las predijo, y los experimentos confirmaron las predicciones.
Los investigadores han puesto ContactSeek v1.0.0 a disposición del público en GitHub y Zenodo, junto con todos los resultados de predicción de AlphaFold3 y los datos de secuenciación. El código está diseñado para ejecutarse en cualquier efector Cas y cualquier desaminasa, dados sitios fuera del objetivo mapeados experimentalmente. El factor limitante ya no es la capacidad de ingeniería sino la calidad de los datos fuera del objetivo introducidos en el modelo.
Lo que ContactSeek demuestra en última instancia es que la resolución de una estructura no es la resolución de la pregunta. Un modelo tridimensional preciso hasta el átomo aún puede pasar por alto los patrones de interacción que distinguen una secuencia de ADN de otra. La probabilidad, no la posición, resultó ser la métrica relevante. Esa es una lección que la biología estructural, todavía poniéndose al día con las herramientas de IA que la transformaron, seguirá absorbiendo durante algún tiempo.
Traducido por Alessandra